本发明具体涉及一种可同时定量检测胃蛋白酶原Ⅰ和II含量的时间分辨荧光免疫层析试纸条与试纸卡以及应用。公开的试纸条中，硝酸纤维素膜上设有相间隔的喷涂有胃蛋白酶原I单克隆抗体I的第一检测带、胃蛋白酶原II单克隆抗体II的第二检测带以及喷涂有兔抗鼠多克隆抗体的质控带,结合垫处喷涂有表面修饰了胃蛋白酶原I单克隆抗体I和II的且含有稀土离子的高分子纳米微球涂层；该试纸条可同时检测胃蛋白酶原Ⅰ和II的含量，解决了现有技术中胃蛋白酶原试纸盒无法同时检测胃蛋白酶原Ⅰ和II的问题，采用该种试纸条，可以保证同一样品液体中的胃蛋白酶原I和II的检测检测结果确度高、误差小，为临床使提供了极大便利。