本发明公开了一种基于水凝胶微孔板的细胞球原位制备方法，属于生物医学技术领域。本发明方法先制备疏水基片和载细胞的微尺度水凝胶模板，通过倒模的方式制备水凝胶微孔板，在培养箱中进行细胞培养原位形成细胞球。本发明中使用载细胞的微尺度水凝胶作为构建带有球面微孔的水凝胶微孔板，无需后续人为进行细胞接种，孔内细胞密度可控，易于构建大小可控、形状规则的细胞球。本方法成本低、操作简单、可重复性好、适用范围广，在组织工程和再生医学以及药物筛选等领域中具有广阔的应用前景。