本发明公开了一种乳腺癌前哨淋巴结示踪剂吲哚菁绿-利妥昔单抗的制备方法，将吲哚菁绿溶液缓慢滴入利妥昔单抗溶液中，迅速振荡混匀反应，偶联反应后将装有偶联反应物的离心管进行离心沉淀，观察有无沉淀生成，若有沉淀生成，则去除离心管底部的沉淀后，取上清液置于半透膜制成的透析袋中；将透析袋浸入灭菌注射用水的透析液中透析，吲哚菁绿经过偶联反应结合到利妥昔单抗上，制成吲哚菁绿-利妥昔单抗结合的新型示踪剂。该制备方法简单、安全、无辐射，制得的吲哚菁绿-利妥昔单抗能满足前哨淋巴结显像和定位的要求。