本发明提供一种枯草芽孢杆菌抗菌肽及其分离纯化方法和应用。本发明的方法包括步骤：S1，对枯草芽孢杆菌发酵液进行菌液分离，除去菌体；S2，加入硫酸铵，静置分离出蛋白沉淀，用缓冲液重溶蛋白沉淀，后于超滤系统下收集滤出液；S3，对粗提液进行脱盐层析，收集UV280下的首个吸收峰产物；S4，对步骤S3脱盐层析产物进行离子交换层析，收集洗脱液100％时UV280下的吸收峰产物并进行冻干浓缩；S5，将冻干的离子交换层析产物重溶，后用蛋白质纯化系统进行疏水层析，收取缓冲液15％时的UV280产物峰产物，能获得高纯度的单一组分，无杂质蛋白，对植物病原菌具有显著抑菌活性。