本发明公开了一种艾滋病治疗药物3TC和FTC耐药突变位点的引物对和探针，包括检测HIV-1病毒RNA的pol基因的第184位、151位和65位突变位点M184V、M184I、Q151M和K65R的ARMS引物和Taqman探针。本发明还提供了上述引物对和探针在检测3TC和FTC主要耐药突变位点M184V，M184I、Q151M和K65R中的应用。本发明试剂盒检测灵敏度高、特异性好、检测成本低，为临床艾滋病患者治疗提供了用药指导，实现了艾滋病患者个体化治疗，能够提高药物有效果性，延长艾滋病患者生存时间，具有广泛应用前景和社会效益。