本发明公开了一种带胶束粒子隔层且表面羧基化的荧光微球及其制备方法，属于荧光传感材料技术领域。将聚(丙烯酸‑苯乙烯)嵌段共聚物在四氢呋喃和水的混合溶剂中自组装，得到聚(丙烯酸‑苯乙烯)聚合物胶束粒子溶液；以表面磺酸基化的聚苯乙烯‑二乙烯基苯交联微球为核，在核的表面由静电力驱动，层层自组装交替沉积对亚苯基亚乙烯前驱体和聚(丙烯酸‑苯乙烯)胶束粒子,再经热处理,得到对亚苯基亚乙烯/聚(丙烯酸‑苯乙烯)胶束壳层。本发明提供的荧光微球，其最大发射波长为510～520 nm；荧光微球结构稳定，表面形貌和分散性能良好；制备工艺简单，操作方便，适合于工业化生产，产品可应用于生物检测、医学诊断等领域。