本发明公开了属于生物工程技术领域的一种凝血酶的制备方法。该方法利用壳聚糖‑精氨酸阴离子树脂加入抗凝血浆中吸附凝血酶原，将凝血酶原激活后，用肝素‑壳聚糖亲和磁性微球进行亲和层析分离。该方法采用壳聚糖‑精氨酸阴离子树脂吸附凝血酶原，吸附效果较好，采用肝素‑壳聚糖亲和磁性微球进行凝血酶特异性纯化，纯化速度快，酶活性高，纯化后的凝血酶比活性最高可为1928.7IU/mg，肝素‑壳聚糖亲和磁性微球经处理后可重复利用。本发明的方法工艺流程简单，在常温常压下进行即可，并且可以应用于大规模生产，生产周期短、操作简单、整个工艺生产仅需2天。