本发明公开了一种分离羊毛甾醇和二氢羊毛甾醇的方法，其特征在于，将羊毛甾醇和二氢羊毛甾醇混合物粗品溶解于溶剂中配成原料液，用萃取剂进行分馏萃取，用洗涤剂进行洗涤，收集重相萃取液浓缩得到羊毛甾醇浓缩物，再经过溶剂结晶得到羊毛甾醇纯品；收集轻相萃余液得到二氢羊毛甾醇浓缩物，再经过溶剂结晶得到二氢羊毛甾醇纯品；其中，溶解混合物粗品的溶剂为石油醚、己烷或辛烷中的一种；萃取剂是甲醇、辛醇、环丁砜或N,N?二甲酰胺中的一种或其混合物；洗涤剂是石油醚、己烷或辛烷中的一种。本发明采用的溶剂均为工业化常用溶剂，本发明工艺简单、操作稳定、产能大、产品质量高、生产成本低，不污染环境，适合于工业化生产。