本发明公开了一种番鸭细小病毒VP3基因重组鸡痘病毒转移载体及其构建方法。以鸡痘病毒基因组为模板扩增TK基因的同源重组臂TKL、TKR，并将其连接成带有多克隆位点MCS的TK片段，再连入骨架质粒，得质粒pTK；合成反向串联表达盒S，并将其插入质粒pTK中，得质粒pTKS；在早期启动子P7.5后的MCS1处插入VP3基因，晚期启动子P11后的MCS2处插入EGFP BGH pA，即得目的转移载体pTKS‑VP3‑EGFP。将pTKS‑VP3‑EGFP转染鸡痘病毒感染的鸡胚成纤维细胞后，经RT‑PCR和荧光蛋白检测VP3能够正常表达。本发明为进一步研制安全、高效的MDPV重组鸡痘病毒疫苗奠定了基础。