本发明公开了血清高密度脂蛋白中胆固醇的测定试剂，包括适量防腐剂、稳定剂、色原、高亲和性酶化合物、表面活性剂、牛血清白蛋白，其特征在于：所述的高亲和性酶化合物是按照以下方法制备得到：1)酶的活化：酶的选择、酶的预培养、酶的活化培养、脱水反应；2)制备高亲和性酶化合物：化合物选择、混合反应。该试剂能够在各种型号的全自动生化分析仪上对高密度脂蛋白中胆固醇进行检测，无需样本离心、沉淀等繁杂操作，大幅降低了检测工作量，缩短了检测时间，降低了检测成本；并且试剂特异性好、灵敏度高，检测准确率高，与国家推荐的Friedewald公式检测结果比较，相关性达到0.997以上。