本发明涉及一种5基因缺失伪狂犬病重组病毒活疫苗及其制备方法。该疫苗是以自行分离的一株伪狂犬病病毒(SX株)为母本，通过分子生物学、细胞生物学等手段，缺失gE基因、gI基因、US9基因、UL49.5部分基因和TK基因，获得的1株伪狂犬病病毒5基因缺失病毒株(rPRV/gE‑/gI‑/US9‑/△UL49.5/TK‑)作为生产种毒，接种CEF细胞单层后经培养收获病毒液，加入冻干保护剂进行冷冻真空干燥而成，该疫苗可用于预防伪狂犬病。