本发明公开了一种检测异菌脲的试纸条及其制备方法和应用，试纸条包括样品吸收垫（1）、结合物释放垫（2）、反应膜（3）、吸水垫（4）和底板（5），其特征在于：所述反应膜上具有包被有异菌脲半抗原‑载体蛋白偶联物的检测区（6）和包被有羊抗鼠抗抗体的质控区（7），所述结合物释放垫（2）喷涂有异菌脲单克隆抗体‑胶体金标记物。本发明还提供了一种制备上述异菌脲试纸条检测烟叶中异菌脲残留的方法。本发明所提供的试纸条具有操作简单、无需样品前处理、灵敏度高、检测速度快、成本低等特点，适合大量样品的筛查和现场监控。