本发明涉及分泌抗人凝血因子VIII单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其制备方法。本发明通过用牛血清白蛋白BSA与人凝血因子VIII偶联后的偶联物作为抗原免疫Balb/c小鼠，取其脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合，用HAT培养基进行选择性培养，利用有限稀释法通过多次克隆化，最后筛选获得稳定分泌抗人凝血因子VIII单克隆抗体的杂交瘤细胞株。根据本发明制备的一株杂交瘤细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC C2015196。