本发明提供了一种检测多菌灵的酶联免疫试剂盒，它包括：包被有包被原的酶标板、多菌灵标准品溶液、多菌灵抗体、酶标二抗、底物显色液、终止液、洗涤液、复溶液，所述包被原为多菌灵偶联抗原，所述酶标二抗为酶标记的多菌灵抗抗体。本发明还公开了一种应用上述酶联免疫试剂盒检测多菌灵的方法，它包括：首先进行样品前处理，然后用试剂盒进行检测，最后分析检测结果。本发明提供的酶联免疫试剂盒可用于检测烟叶样本中多菌灵的含量，其操作简便、费用低廉、灵敏度高、能够现场监控且适合大量样本的筛查。