本发明涉及一种富含生物活性物质的蛹虫草提取物制备方法，属于功能食品领域。通过制备含有超氧化物歧化酶、糖苷酶、转移酶、水解酶、异构酶等生物酶的蛹虫草生物转化复合酶系，进行蛹虫草复合酶系水解反应，再通过蛹虫草生物活性物质高效动态循环提取，微孔滤膜过滤，真空减压浓缩等步骤，得到富含生物活性物质的蛹虫草提取物。与目前已公开的蛹虫草提取物制备方法相比，该方法大幅提高提取物中虫草素、虫草酸、虫草多糖、腺苷等生物活性物质的含量。由于制备过程中采用高效生物复合酶转化等方法，对蛹虫草中活性物质成分进行二次生物转化，因此提取物中生物活性物质含量均高于蛹虫草子实体中的相应含量，具有很好的开发应用前景。