本发明公开了一种检测细胞内CO的荧光探针及其制备方法和应用，一种检测细胞内CO的荧光探针，结构式如下：其中，R为H、‑CH3、‑CH2CH3或‑COOEt。本发明合成新型环钯基团能够对CO的响应性更快更灵敏，其与BODIPY结合后不仅提高了对CO的选择性，而且实现更快更灵敏的检测CO。其制备方法是对硝基苯甲酰氯、二甲基吡咯和三氟化硼乙醚，或对硝基苯甲酰氯、二甲基吡咯衍生物和三氟化硼乙醚反应生成硝基苯基氟硼二吡咯(硝基苯基BODIPY)，然后将硝基苯基BODIPY中的硝基还原成氨基，再加入亚硝酸盐和3,5‑二甲基苯酚偶氮化反应，最后加入钯盐进行环钯化反应得到目标产物，即检测细胞内CO的荧光探针(ACP‑CO)。本发明合成方法简单，适于工业化生产。