本发明提供酶法生产生物柴油和多元不饱和脂肪酸酯富集的耦合工艺，包括：S1、将油脂水解成脂肪酸；S2、水解产物进行油水两相分离；S3、用脂肪酶催化油相发生醇解反应，反应过程中通过控制短链醇流加和实行在线脱水，消除副产物水对脂肪酶和产物得率的影响，实现从脂肪酸到生物柴油的转化；S4、将S3所得反应液流入下一阶段酶反应器中，使反应液中未反应完全的甘油酯和脂肪酸在酶催化下与碳酸二甲酯或碳酸二乙酯发生反应，生成多元不饱和脂肪酸酯，反应过程中实行在线脱水以除去反应过程中生成的副产物水，进而实现从油脂到生物柴油以及多元不饱和脂肪酸酯的转化。本工艺具有油脂原料适用性强，生产过程环保清洁，产品品质及得率高等优点。