本发明公开了一种芽胞杆菌多基因叠加敲除方法，是将芽胞杆菌多个待敲除基因的上下游同源臂基因片段插入到温敏型质粒中，转化芽孢杆菌，通过高温培养迫使芽胞杆菌中的敲除质粒与其基因组DNA发生同源单交换，高温传代培养筛选双交换的菌株。提取多个基因单交换成功菌株的基因组DNA，限制性内切酶消化后，回收DNA片段，转化单基因成功实现无痕敲除的菌株，进行双交换筛选，叠加敲除成功的菌株作为下一轮叠加敲除的宿主菌，依次叠加最终实现芽胞杆菌多基因的敲除。用温敏型质粒实现芽胞杆菌基因的无痕敲除，以单交换的宿主基因组DNA转化芽胞杆菌不仅能提高转化效率，还能有效避免宿主菌中已敲除基因的回复，显著提高多基因叠加敲除效率。