本发明公开了一种虾青素亚油酸单酯的制备方法，包括以下步骤：步骤一、粗提液的制备：用天平称取5.0 g雨生红球藻藻粉，加入纤维素酶液，破壁，离心，弃上清后，丙酮浸提，再次离心后，弃去下层沉淀，制得粗提液；步骤二、溶剂系统的建立：配制正己烷‑乙腈‑甲醇一级溶剂系统和配制正己烷‑甲醇二级溶剂系统；步骤三、高速逆流色谱纯化：在474nm波长下采集数据，首先以所述一级溶剂系统为实验条件，收集洗脱时间为12‑20min的组分，再以二级溶剂系统为实验条件，收集洗脱时间为52‑60min的组分，制得化合物，即虾青素亚油酸单酯。本发明首次采用高速逆流色谱纯化法从雨生红球藻藻粉分离得到了虾青素亚油酸单酯，从而对后续虾青素酯的研究具有重大意义。