本发明的一种脂肽自组装凝胶及其制备方法和应用，其中脂肽由活性肽片段、间隔臂、交联臂、疏水片段组成，基于亲疏水以及巯基相互作用，调节脂肽溶液pH值即可自组装成凝胶。本发明的一种脂肽自组装凝胶的制备方法包括下列步骤：通过固相合成法分别合成活性肽片段、间隔臂、交联臂三种短肽；采用碳二亚胺法偶联活性肽片段和间隔臂，偶联交联臂和疏水片段，得到两种中间产物，进一步将中间产物偶联得到含活性肽片段、间隔臂、交联臂和疏水片段的脂肽产物；配制脂肽水溶液，调节pH值，制得脂肽凝胶。脂肽自组装凝胶易于涂覆生物材料表面，应用范围广，对浮游细菌和生物膜细菌均有较强作用，有效减少感染的发生，且不易产生耐药性。