本发明涉及医药领域，具体涉及一种来源于马粪海胆生殖腺的水溶性多糖的制备方法及其应用。本发明具体方法为高温加热使海胆生殖腺中的酶失活，然后以低于60℃水提取多糖，提取液离心，上清液减压浓缩，依次用木瓜蛋白酶酶解和Sevage法除蛋白，水溶液经透析、醇沉、干燥得海胆总多糖，总多糖用凝胶柱色谱分离纯化得到两个多糖。本发明所用的提取温度低，不影响多糖结构和活性，提取液中杂质少，后处理方法简单，极大地降低了生产成本。所得总多糖性状和复溶性好，易于制备多种药物制剂。总多糖及其含有的两种多糖均有较好的抗肿瘤作用，可开发成无毒副作用的抗肿瘤药物。