本发明涉及一种尺寸可调的荧光碳氮纳米片制备方法和应用，属于纳米技术领域。方法包括：采用水热反应的方法制备碳氮纳米片，称取1‑2g聚合物，分散于10‑20mL去离子水中，放置于反应釜内，在反应温度100‑240℃高温炉中加热4‑6小时，获得黄色溶液；然后把反应液倒入7000‑14000透析袋内透析，透析时间为2‑4天,即得到浅黄色的固体粉末。在拥有细胞的培养皿中加入所述碳氮纳米片溶液，孵育2‑4小时后，置于双光子共聚焦显微镜下成像。所述方法可以利用价格低廉的原料和简单的制备工艺过程，得到良好水溶性的荧光碳氮纳米片，且尺寸可调，所制备的碳氮纳米片可用做细胞的双光子荧光成像分析。