本发明建立了一种体外快速扩增CD8+T细胞及其功能性细胞亚群的方法。在常规培养扩增CD8+T细胞的体外培养体系中，增加TLR1/2激动剂、TLR2/6激动剂、TLR5激动剂或联合使用上述激动剂可显著提升CD8+T细胞的扩增效率；此外，TLR激动剂的使用可以使常规培养条件下难以扩增的功能性CD8+T细胞亚群得以扩增，如PD‑1+CD8+T细胞、TEM CD8+T细胞等；CD8+T细胞及其功能性细胞亚群在TLRs激动剂和重组细胞因子IL‑2、IL‑7、IL‑15以及抗人CD3抗体和抗人CD28抗体包被的磁珠的共同持续刺激下快速大量增殖。