本发明公开了一种抗虫耐草甘膦表达载体、质粒及其应用，所述表达载体含有抗虫基因cry1Ab、抗虫基因cry2Ab和草甘膦抗性基因G10evo。本发明载体同时表达Cry1Ab、Cry2Ab和G10evo蛋白，用该载体转化农作物获得的转基因作物能够同时抗棉铃虫、甜菜夜蛾、玉米螟、二化螟等水稻、玉米和棉花的主要鳞翅目害虫，不但拓宽了杀虫谱，而且还有效地延缓了害虫抗性的发生，同时使转基因作物具有抗草甘膦的能力，这种复合性状转基因作物符合目前转基因作物的研发方向，更能满足大规模农业生产的需求。