本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种禽流感病毒H9亚型灭活疫苗的制备方法。本发明采用LMH传代细胞系作为载体细胞进行病毒增殖，采用谷氨酰胺、重组人胰岛素、人血清白蛋白、转铁蛋白、生物素和生长因子组成的培养基A进行培养，收集病毒液，灭活，制备成疫苗。本发明采用LMH传代细胞系进行禽流感H9亚型病毒增殖不需要额外添加胰酶，而且LMH细胞背景清楚，无外源病原，易增殖，可以有效的简化工艺，降低成本。而且本发明制备得到的禽流感病毒H9亚型灭活疫苗的病毒含量高、稳定性好，安全性高，是一种较为理想的禽流感病毒H9亚型灭活疫苗。