一种具有大斯托克斯位移的近红外发射氧杂蒽荧光染料制备方法及应用，本发明的优点是：通过直线延长氧杂蒽共轭体系的策略设计合成一类最大吸收波长超过600nm，最大荧光发射波长超过730nm，Stokes位移超过100nm的氧杂蒽荧光染料，是目前已知罗丹明荧光染料中斯托克斯位移最大的荧光染料之一。细胞成像实验中，该染料展示出好的水溶性、生物相容性、小的生物毒性，靶向定位溶酶体。另外，染料结构中含有螺环内酯结构，可作为近红外发射染料荧光报告基团进行多种近红外发射荧光开启型生物荧光探针的设计。总之，本发明提供了一种具有大斯托克斯位移的近红外发射氧杂蒽染料的设计合成方法，并将其用于荧光探针设计开发中。