本发明属于光学分子影像技术领域，公开了一种单视图切伦科夫发光断层成像重建方法，包括：利用光学相机探测被测物体的表面光学信息；获取生物体组织结构信息和光学特性参数；将光学相机获取的二维光学数据映射到生物体表面，得到生物体表面的三维荧光数据分布；将重建对象的解剖结构信息和光学特性参数作为先验信息，建立表面的测量数据与内部未知光源的线性关系；对网格全域通过稀疏贝叶斯学习算法重建，实现目标内部放射性核素探针的三维分布；将重建结果和成像对象的解剖结构进行图像融合并显示。本发明有效提高了切伦科夫断层成像的重建结果，在光学断层三维重建算法等领域有重要的应用价值。