本发明公开了一种检测H7N9经典毒株与高致病性变异毒株的多重荧光RT‑PCR试剂盒，提供了用于检测H7N9病毒经典毒株和变异毒株血凝素(HA)特异性基因的引物对和MGB探针，用于检测H7N9病毒神经氨酸酶基因(NA)的引物对和MGB探针，以及包括它们的试剂盒和试剂盒使用方法。本试剂盒的原理是：以H7N9禽流感病毒变异毒株的HA突变基因为分子标识，结合保守的神经氨酸酶(NA)基因，制备H7N9病毒经典毒株和变异毒株多重荧光检测试剂盒。本试剂盒可快速甄别H7N9禽流感病毒经典毒株和高致病性变异毒株，为H7N9禽流感病毒变异早期预警提供了强有力的技术支撑，可广泛应用于动物检验检疫、流行病学调查、疫病防控等领域。