本发明公开一组检测锥虫属原虫的特异性引物，其序列为：上游引物为：5’‑CCTGATGAAAGGTGCAATG(SEQ ID NO:1)或其互补序列；下游引物为：5’‑CGTTTTCGCCTTCTTGTGGA(SEQ ID NO:2)或其互补序列。本发明还公开一种对锥虫属原虫进行特异性检测的方法，包括以下步骤：(1)提取目标样本的基因组DNA；(2)以步骤(1)中所提取的目标样本的基因组DNA作为模板，用本发明提供的特异性引物进行PCR扩增；(3)对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳实验，观察目标位置是否出现特异性条带。本发明提供的检测锥虫属原虫的特异性引物及检测方法，能够快速准确的检测出目标样品中是否含有锥虫属原虫，该检测方法的属内通用性高，属间特异性强，可专门针对锥虫属原虫进行有效的检测。本发明还提供上述引物的应用。