本发明提供一种复制型重组腺病毒HAdV‑5载体系统，其包括骨架质粒pKAd5、中间质粒pMDXE3YA和穿梭质粒pKNXE3M。将目的基因编码区克隆到穿梭质粒的多克隆位点，EcoRI酶切携带目的基因的穿梭质粒，用所得片段替换中间质粒的对应部位；再用NdeI酶切新构建的中间质粒，用所得片段替换骨架质粒的对应部位，可获得重组腺病毒质粒；PacI线性化的重组腺病毒质粒转染293细胞，能够制备由HAdV‑5主要晚期启动子(MLP)控制目的基因表达的重组HAdV‑5腺病毒。该重组腺病毒在各种人类细胞中均可以复制增殖，是复制型病毒，预计其在动物口服载体疫苗研发中具有广阔的应用前景。