本发明公开了痢疾性阿米巴虫荧光定量PCR检测试剂盒及非诊断性检测方法，所述试剂盒包括PCR反应液，所述PCR反应液包括具有如下核苷酸序列的引物和Taqman探针：上游引物：5’‑ATGACTCAAAAACAGGAACAT‑3’，下游引物：5’‑TACAAATTTACCACTTTCACATACTG‑3’，Taqman探针：5’‑AGCAACTGTTCAACCAACACCAGCATGT‑3’。本发明能够快速、有效地检测痢疾性阿米巴虫，所述非诊断性检测方法准确性、特异性和敏感性高，所述检测试剂盒灵敏、稳定、有效。