本发明公开了一种来源于鸡蛋溶菌酶的抗菌肽混合物及其制备方法和应用，属于分子生物学技术领域。所述抗菌肽混合物的制备方法，包括：利用碱性蛋白酶对鸡蛋溶菌酶进行酶解得到粗提物，经分离纯化，收集具有抗菌活性的纯化产物，获得所述的抗菌肽混合物。本发明利用碱性蛋白酶对鸡蛋溶菌酶进行酶解，其酶解产物对金黄色葡萄球菌的抑菌活性较鸡蛋溶菌酶的抑菌活性提高了40％，其抗菌活性显著提升，扩大了鸡蛋溶菌酶的应用范围；本发明提供的制备工艺具有简单、快速、高效的特点，适合工业化生产。