本发明公开了一种高转化率运动发酵单胞菌的构建方法；同时本发明还涉及一种高转化率运动发酵单胞菌；第三方面本发明还涉及一种高转化率运动发酵单胞菌在基因工程领域的应用。构建方法包括：结合参考文献及数据库对运动发酵单胞菌Zymononas mobilis ZM4全基因组限制-修饰系统相关基因进行预测；对预测到的两个和限制修饰系统相关的基因分别设计基因敲除引物，以ZM4和ZM401为出发菌株，通过质粒pEX18Tc敲除掉相关基因，最终得到的ZM4m和ZM401m为限制-修饰系统相关基因敲除菌株。本发明所得菌株的转化效率明显提高，获得的转化子数目多，阳性率高，在生长性能和发酵性能方面和野生型菌株无异。以双敲除菌株作为出发菌株更有利于运动发酵单胞菌的分子改造及相关的机理研究。