本发明公开了多功能植物双元质粒pPBEL-BiFC的构建方法及其应用，属于基因工程技术领域，该方法包括以下步骤：改造原有的多克隆位点，把原有的MCS区进行敲除，引入两段新的MCS区，可以有更多的酶切位点选择。对原有的GFP进行改造，代替GFP，引入YFP-C段和YFP-N段在载体的不同位置，YFP-C段和YFP-N段分别在两个载体的局面。引入了HA和MYC标签，能进行western-blot蛋白检测，HA上连接A蛋白，MYC上连接B蛋白，通过检测A蛋白进行western-blot分析，进而检测是否有B蛋白存在，反之亦然。本发明构建的质粒能进行Co-IP免疫共沉淀反应。