本发明属于鱼类精子冷冻保存技术领域，具体公开了一种泥鳅精子的超低温冷冻保存液及其冷冻复苏方法和应用。利用该方法对泥鳅的精子进行超低温（-196℃）冷冻保存，复苏后的精子活率达72.3%。用复苏后的精子对泥鳅卵受精，受精率达81.5%，孵化率达84.9%，与鲜精没有显著性差异（P＞0.05）。本方法冻存量大、效果好、简便易行、无需昂贵的仪器设备，能解决实际生产中泥鳅雄性个体少、精卵适时受精等问题，为泥鳅苗种的规模化生产和遗传育种研究提供便利。