本发明提供了一种仿生纳米红细胞基因载体及其制备方法与应用。所述的仿生纳米红细胞基因载体，包括红细胞膜和包覆于红细胞膜中的可电荷反转的内核。本发明还提供了该仿生纳米红细胞基因载体的制备方法，通过酰胺反应合成可电荷反转的基因载体；再通过挤压法将可电荷反转的基因载体内核包覆于红细胞膜中。本发明首次运用生物膜包裹治疗基因用于疾病治疗，不仅可以保证内核的负电性，成功被红细胞膜包裹，实现了基因药物在体内的长循环，并在病灶微环境下可实现电荷反转从而释放核酸药物。同时该基因载体无细胞毒性，并可在体内完成无毒化的代谢，为基因治疗提供了一类全新的安全、高效的基因载体，具有广阔的应用前景。