本发明公开了一种高效液相色谱测定油井注采液中磺基甜菜碱表活剂含量的方法，是采用空白油井注入液制备标准品溶液、供试品溶液，以20µL的进样量进样后，按照外标法计算含量；高效液相色谱条件为：色谱柱：C18色谱柱；检测器：蒸发光散射检测器；流动相：甲醇、水为流动相，梯度洗脱，0~2 min为70%甲醇，2.01 min后为100%甲醇；气流速度：2~2.5 L/min；蒸发温度：110~120℃。本发明检测方法具有分析速度快，操作简便，安全可靠；且通过外标法对样品中磺基甜菜碱表活剂含量进行定量，干扰因素少，准确度高，重复性好，灵敏度高。