本发明公开了一种防治根结线虫病的土壤处理剂及其制备方法和应用方法，土壤处理包括杀线主剂和杀线增效剂，杀线主剂包含杀线有机原料和促分解辅料；当杀线有机原料为固体有机原料时，杀线有机原料包含农作物秸秆和糖厂下脚料中的至少一种；当杀线有机原料为液体有机原料时，杀线有机原料包含酒精发酵液和糖蜜中的至少一种；促分解辅料包含有机催化物和专用微生物中的至少一种。本发明的土壤处理剂可在土著微生物厌氧分解过程中分泌产生大量的杀线物质，如细胞壁降解酶、乙酸等，且快速创造的厌氧环境也能杀灭线虫，从而降低根结线虫病高发土壤中根结线虫的数量和该属在线虫群落中的占比，减轻后茬作物根结线虫病害发生率。