本发明公开了一种检测香豆素的时间分辨荧光免疫层析试纸条及其制备方法和应用。该试纸条包括底板及在底板上依次搭接粘贴的样品吸收垫、结合物释放垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述结合物释放垫上包埋有荧光微球标记的香豆素单克隆抗体，所述硝酸纤维素膜上固定有检测区和质控区，所述检测区喷涂有香豆素半抗原‑载体蛋白偶联物，所述质控区喷涂有羊抗鼠抗抗体，所述香豆素半抗原是由香豆素进行缩醛反应得到的。本发明还提供了该试纸条的制备方法及应用上述试纸条检测样品中香豆素的方法。本发明提供的试纸条和检测方法具有操作简单、灵敏度高、检测速度快、成本低的优点，能够实现对大批量样品中香豆素的快速检测和现场监控。