本发明公开了一种木糖醇基因工程生产菌及其构建方法和应用，属于基因工程技术领域。所述的木糖醇基因工程生产菌，由大肠杆菌W3110经基因组改造得到，原始大肠杆菌W3110基因组中的ptsG、xylAB和ptsF均替换成木糖还原酶基因XR；还包括基因组中pfkA、pfkB、pgi、sthA中的至少一个替换成XR。本发明以大肠杆菌W3110为出发菌株，将基因组中的相应基因均替换成XR，木糖还原酶得以高效表达，同时通过阻断木糖的代谢和木糖醇的磷酸化，提高对木糖的利用，并且通过阻断或减少EMP途径葡萄糖代谢通量强化NADPH再生，为木糖还原酶还原木糖生成木糖醇提供必需的辅酶NADPH，极大提高基因工程菌转化木糖生产木糖醇的效率。