本发明提供了一种公主岭霉素抑菌活性检测方法及应用，涉及抑菌活性检测方法技术领域，所述方法包括如下步骤：提供公主岭霉素水提液和供试菌菌悬液，然后将不同体积比的公主岭霉素水提液和供试菌菌悬液混合，得到公主岭霉素水提液和供试菌菌悬液的临界抑菌体积比，根据该临界抑菌体积比，确定公主岭霉素水提液对供试菌的抑菌活性，缓解了现有的抑菌活性检测方法中物理化学检测方法要求高，微生物法不易操作的技术问题，本发明提供的方法直观性好、灵敏度高、稳定性好、简单方便，耗时短，适用范围广，更安全，更可靠，费用更低，为公主岭霉素抑菌活性检测提供了一种新途径。