本发明提出了一种人食管癌EC9706细胞多药耐药细胞株的建立方法及其应用，以人食管癌EC9706细胞系为亲本细胞，采用紫杉醇模拟体内化疗过程，逐步提高药物浓度、间歇性反复冲击筛选出耐紫杉醇细胞株，测定该细胞株对紫杉醇、阿霉素、长春新碱、顺铂及5‑FU等食管癌常用化疗药物的耐药指数，选出敏感药物5‑FU及顺铂进一步联合诱导建立获得性人食管癌多药耐药细胞系EC9706/PDFC，测定该细胞株的干细胞标志表达明显增高及转移迁移特性增强。本发明采用“筛选多种敏感化疗药物提高浓度间歇冲击+持续诱导”的诱导方法，可用于研究耐药肿瘤的细胞内信号激活机制，筛选具有可靠性的耐药逆转剂及耐药肿瘤细胞的治疗靶点。