本申请公开了一种检测核酸样本污染的方法、试剂盒及应用。本申请检测核酸样本污染的方法，包括采用SNP检测引物对待测核酸样本进行PCR扩增，分析待测核酸样本的单核苷酸多态性，根据单核苷酸多态性分析结果判断待测核酸样本是否存在不同个体来源的核酸污染；SNP检测引物由至少14个SNP位点的分析引物对组成。本申请检测待测核酸样本污染的方法，创造性的利用每个个体SNP的特异性，将其作为待测核酸样本的特异识别信息，如果检测出的待测核酸样本的SNP信息与其自身的SNP信息相符，则判断该待测核酸样本没有污染，如果不符则判断该待测核酸样本存在污染。本申请的检测方法能准确判断待测核酸样本是否存在污染。