一种检测二氯喹啉酸的时间分辨荧光免疫层析试纸条及其制备方法和应用。该试纸条包括底板及在底板上依次搭接粘贴的样品吸收垫、结合物释放垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述结合物释放垫上包埋有荧光微球标记的二氯喹啉酸单克隆抗体，所述硝酸纤维素膜上固定有检测区和质控区，所述检测区喷涂有二氯喹啉酸半抗原‑载体蛋白偶联物，所述质控区喷涂有羊抗鼠抗抗体，所述二氯喹啉酸半抗原是由二氯喹啉酸与(1,3‑二氧杂环己基乙基)溴化镁反应生成丙缩醛二氯喹啉酸，再与三氟乙酸反应得到。本发明提供的试纸条和检测方法具有操作简单、灵敏度高、检测速度快、成本低的优点，能够实现对大批量样品中二氯喹啉酸的快速检测和现场监控。