一种检测氟节胺的时间分辨荧光免疫层析试纸条及其制备方法和应用。该试纸条包括底板、样品吸收垫、结合物释放垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，结合物释放垫上包埋有荧光微球标记的氟节胺单克隆抗体，硝酸纤维素膜上固定有检测区和质控区，检测区喷涂有氟节胺半抗原‑载体蛋白偶联物，质控区喷涂有羊抗鼠抗抗体，氟节胺半抗原是由2‑氯‑1,3‑二硝基‑5‑三氟甲基苯与3‑氨基‑3‑(2‑氯‑6‑氟苯基)‑丙酸反应生成3‑(2‑氯‑6‑氟苯基)‑3‑(2,6‑二硝基‑4‑三氟甲基‑苯氨基)‑丙酸，再与碘乙烷反应得到。本发明的试纸条和检测方法具有操作简单、灵敏度高、检测速度快、成本低的优点，能实现对大批量样品中氟节胺的快速检测。