一种检测啶虫脒的时间分辨荧光免疫层析试纸条及其制备方法和应用。该试纸条包括底板及在底板上依次搭接粘贴的样品吸收垫、结合物释放垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，结合物释放垫上包埋有荧光微球标记的啶虫脒单克隆抗体，硝酸纤维素膜上固定有检测区和质控区，检测区喷涂有啶虫脒半抗原‑载体蛋白偶联物，质控区喷涂有羊抗鼠抗抗体，啶虫脒半抗原是由E‑N‑(4‑(6‑氯吡啶‑3‑基)2‑丁烯‑2‑基)氰胺与氨基丙酸反应得到。本发明还提供了该试纸条的制备方法及应用上述试纸条检测样品中啶虫脒的方法。本发明提供的试纸条和检测方法具有操作简单、灵敏度高、检测速度快、成本低的优点，能够实现对大批量样品中啶虫脒的快速检测和现场监控。