本发明提供了一种检测仲丁灵的酶联免疫试剂盒及其应用，其特征在于：它包括：包被有仲丁灵偶联抗原的酶标板、仲丁灵单克隆抗体、酶标记抗抗体、仲丁灵标准品溶液、底物显色液、终止液、洗涤液、复溶液。所述仲丁灵偶联抗原是由仲丁灵半抗原与载体蛋白偶联得到，所述仲丁灵半抗原是由4‑氯‑3,5‑二硝基苯乙酸与丁胺反应得到。本发明还公开了一种应用上述酶联免疫试剂盒检测仲丁灵残留量的方法，它包括：首先进行样品前处理，然后用试剂盒进行检测，最后分析检测结果。本发明提供的酶联免疫试剂盒可用于检测烟叶中仲丁灵的残留量，其操作简便、费用低廉、灵敏度高、能够现场监控且适合大量样本的筛查。