本发明公开了一种特异性检测铜离子和硫离子的多肽、化学荧光传感器及其制备方法与应用。所述的特异性检测铜离子和硫离子的多肽的氨基酸序列为：HEFH。所述的化学荧光传感器是由所述的特异性检测铜离子和硫离子的多肽与异硫氰酸荧光素链接而成，所述的异硫氰酸荧光素与所述多肽中谷氨酸一侧的组氨酸相连。所述的多肽裂解前加入六氨基己酸，在三乙胺存在下让异硫氰酸荧光素与六氨基己酸反应3~5h得到目标物化学荧光传感器。所述的化学荧光传感器在铜离子检测中的应用为所述的化学荧光传感器在硫离子检测中的应用，所述的化学荧光传感器在细胞毒性检测中的应用。本发明基于多肽的化学荧光传感器选择性好，灵敏度高干扰小，检测限低。