本发明提供了一种青霉素V酰化酶突变体、编码序列、重组表达载体、基因工程菌及应用。对Bacillus sphaericus来源的青霉素V酰化酶进行突变，获得的突变体PVA‑3的比活提高了9倍，固定化活力由92U/g提高到820U/g，在浓度为30％的青霉素V钾盐条件下孵育1小时，活性残余89.1％；固定化突变体PVA‑3应用于pH6.0，25℃条件下裂解25％浓度的青霉素V制备6‑APA的反应时间由180分钟缩短到60分钟，底物转化率提高至99.5％以上，且连续使用600批次以上，活力无明显的损失，具有很好的操作稳定性。突变后的PVA‑3极大程度地降低了生产成本，提高了生产效率，更适合于工业化应用。