本发明公开了一种半连续液体培养高效生产灵芝多糖的方法，该方法的步骤包括：（1）母种的活化扩繁；（2）摇瓶菌种的制备；（3）种子液的制备；（4）一氧化氮和乙烯协同诱导处理；（5）半连续液体培养。本发明采用的半连续液体培养方法可有效延长灵芝菌丝体的对数生长期，提高灵芝液体培养生物量，提高灵芝多糖产量，与常规的分批培养方法相比，本发明工艺合理，操作简单，可节省反复洗罐、灭菌等非发酵时间，提高了生产效率和设备利用率，降低了生产成本，可以用于大规模生产灵芝多糖，是一种很有应用前景的灵芝液体培养方法。